原位雜交（紅色熒光單標(biāo)）

一.項目介紹：

1. 原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進行。

2. 所需器材：

脫水機G-JT12s，包.埋機G-L5/p5,病理切片機RM2016，凍臺G-P1，烤箱GFL-70/230,組織攤片機G-KDP，載玻片及蓋玻片，正置熒光顯微鏡，成像系統(tǒng)，恒溫箱，高壓滅菌鍋，移液槍，鐘擺搖床。

3. 主要試劑：DEPC。原位雜交固定液。PBS緩沖液。20×SSC洗脫液。蛋白酶K。DAPI?？篃晒獯銣绶馄瑒?。雜交液。

 二.石蠟切片熒光探針原位雜交實驗步驟

1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液（DEPC水配制）中固定2-12h。

2、脫水：組織固定完成后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

3、切片：石蠟經(jīng)切片機切片，攤片機撈片，62°烤箱烤片2h。

4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

5、消化：根據(jù)組織固定時間長短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化    min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

6、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

7、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針     雜交液, 濃度    ，恒溫箱     度雜交過夜。

8、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

9、DAPI復(fù)染核：切片滴加DAPI染液，避光孵育8min，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。

10.鏡檢拍照：切片于尼康正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm,發(fā)藍光；FAM(488)綠光激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光；CY3紅光激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光。）DAPI染核，為藍光。

注意事項：

1.mRNA為檢測對象時，需嚴格要求實驗環(huán)境經(jīng)無RNA酶處理。

2.FISH切片保存時間較短，應(yīng)盡快取圖。

原位雜交（紅色熒光單標(biāo)）

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